培养基的灭菌

　　● 知识要点和教学要求

　　1)、了解灭菌的原理和方法

　　2)、了解培养基的灭菌

　　3)、掌握湿热灭菌原理和影响灭菌的因素

　　4)、掌握间歇灭菌

　　5)、掌握连续灭菌

　　● 能力培养要求

　　通过本章节的学习，学生能掌握培养基灭菌的原理和方法及其影响灭菌的因素。

　　● 教案内容

　　由于杂菌的污染，使生物反应中的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降;

　　由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化性质，使产物 的提取和分离变得困难，造成收率降低或使产品的质量下降;

　　杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的PH值，从而使生物反应发生异常变化;

　　杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败;

　　发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败，等等。

　　5.1 灭菌的原理和方法

　　灭菌是指利用物理或化学法杀或除去物料及设备中一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法大致有以下几种：

　　1. 化学试剂灭菌法

　　常用的化学试剂有甲醛、氯气(或次氯酸钠)、高锰酸钾、环氧乙烷等。

　　2. 电磁波、射线灭菌法

　　电磁波、紫外线或放射性物质

　　3. 干热灭菌法

　　干热灭菌条件为在160℃下保温1h。

　　4. 湿热灭菌法

　　利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。从灭菌的效果来看，干热灭菌不如湿热灭菌有效，温度升高10℃时，灭菌速度常数仅增加2-3倍，而湿热灭菌对耐热芽孢的灭菌速度常数增加的倍数可达到8-10倍，对营养细胞则更高。同时，蒸汽的来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠，是目前最为基本的灭菌方法。一般的湿热灭菌条件为：121℃，30min。

　　5. 过滤除菌法

　　利用过滤方法制备无菌空气。

　　6. 火焰灭菌法

　　仅适用于接种针、玻璃棒、三角瓶口等的灭菌。

　　5. 2培养基的灭菌

　　但高温虽然能杀死培养基中的杂菌，同时也会破坏培养基中的营养成分，甚至会产生不利于菌体生长的物质。因此，在工业培养过程中，除了尽可能杀死培养基中的杂菌外，还要尽可能减少培养基中营养成分的损失，最常用的灭菌条件是120℃，20-30min。

　　衡量热灭菌的指标很多，最常用的是“热死时间”，即在规定温度下杀死一定比例的微生物所需要的时间。杀死微生物的极限温度称为致死温度，在此温度下，杀死全部微生物所需要的时间称为致死时间。在致死温度以下，温度越高，致死时间就越短。一些细菌芽孢菌等微生物细胞和孢子，对热的抵抗力不同，因此它们的致死温度和时间也有差别，见表5-3和表5-4。微生物对热的抵抗力常用“热阻”表示。热阻是指微生物在某一特定条件(主要是温度和加热方式)下的致死时间。相对热阻是指微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。表5-5列出了某些微生物的相对热阻。

　　表5-5某些微生物的相对热阻及其对一些灭菌剂的相对抵抗力(大肠杆菌相比较)

　　灭菌方式大肠杆菌霉菌孢子细菌芽孢嗜菌体或病毒

　　干热灭菌1 2-10 1000 1

　　湿热灭菌1 2-10 3×1051-5

　　苯酚1 1-2 1×10930

　　甲醛1 2-10 250 2

　　紫外线1 5-100 2-5 5-10

　　由表5-5可知，芽孢或孢子的热阻要比生长期营养细胞的热阻大得多，这是由于芽孢或孢子内吡啶二羧酸含量对热阻的增加有关。另外，芽孢子中蛋白质含水量较营养细胞低(特别是游离水分少)，也是芽孢耐热强的一个原因。图5-2和图5-3分别为大肠杆菌营养细胞和FS7954芽孢杆菌的芽孢在不同温度下的死亡情况。

　　5.3湿热灭菌原理和影响灭菌的因素

　　在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌，广泛使用湿热灭菌法。工厂里，蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。用湿热灭菌的方法处理培养基，其加热温度和受热时间与来菌程度和营养成分的破坏都有关系。营养成分的养活将影响菌种的培养和产物的生成，所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾，恰当掌握加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。

　　5.3.1灭菌动力学

　　1. 微生物的死亡速率

　　1)对数残留定律

　　微生物受热死亡的原因，主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热而丧失活力，但其物理性质不变。在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论。在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残留活菌数的减少而递减，即微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，如图5-2所示，大肠杆菌的死亡曲线为线性关系，称之为对数残留定律，也即反映为一级化学反应动力学为：

　　-dN/dt=KN

　　式中，N—残存的活菌数;t—灭菌时间(s);K—灭菌速度常数(s-1)，与称反应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关;dN/dt—活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。

　　上式通过积分可得：Nt/N0=e-kt

　　t=1/KlnN0/Nt=2.303/KlgN0/Nt

　　式中：N0—开始灭菌(t=0)时原有活菌数;Nt=经时间t后残存活菌数。

　　上式是计算灭菌的基本公式，灭菌速度常数K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。各种微生物在同样的温度下K值是不同的，K值愈小，则此微生物愈耐热。

　　即使对于同一微生物，也受微生物的生理状态、生长条件及灭菌方法等多种因素的影响，其营养细胞和芽孢的比死亡速率也有极大的差异，就微生物的热阻来说，细菌芽孢是比较耐热的，孢子的热阻要比生长期细胞大得多。例如，在121℃时，枯草杆菌FS5230的K为0.47-0.063s-1，梭状芽孢杆菌PA3679的K为0.03s-1，嗜热芽孢杆菌FS1518的K为0.013s-1，热芽孢杆菌FS617的K为0.048s-1。

　　从上述的微生物对数死亡规律和非对数死亡动力学模型方程式可知，如果要达到彻底灭菌，即灭菌结束时残留的活微生物数等于0，则灭菌所需的时间应为无限长，这在实际中是不可能的。因此，工程上，在进行灭菌的设计时，常认为N/N0=0.001，即在1000次灭菌中，允许有一次失败。

　　5.3.2灭菌的温度和时间

　　微生物的受热死亡属于单分子反应，其灭菌速率常数K与温度之间的关系可用阿累尼乌斯公式表示：

　　K=Aexp(-ΔE/RT) (5.8)

　　或 lnK=lnA--ΔE/RT (5.9)

　　式中：A---频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1;R---气体常数，8.314J/mol·K;T---绝对温度，K;ΔE---微生物死亡活化能，J/mol。

　　由此可见，ΔE/R是微生物受热死亡时对温度敏感性的度量，此值越大，表明微生物死亡速率随温度的变化越敏感;反之，就越不敏感，因此，在灭菌操作中，ΔE/R是一个十分重要的参数。

　　当培养基被加热灭菌时，常会出现这样的矛盾，这就是，加热时，微生物固然会被杀死，但培养基中的有用成分也会随之遭到破坏，那么有何良策可以既达到灭菌要求，同时又不破坏或尽可能少破坏培养基中的有用成分呢?

　　实践证明，在高压加热的情况下，培养基中的氨基酸和维生素极易被破坏，如在121℃，仅20min，就有59%的赖氨酸和精氨酸及其他碱性氨基酸被破坏，蛋氨酸和色氨酸也有相当数量被破坏。因此，必须选择一个既能满足灭菌需要，又可使培养基的破坏尽可能养活的灭菌工艺条件。

　　由于灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分的破坏活化能值，因此：

　　即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分的破坏速率的增加倍数。也就是说，当灭菌温度上升时，微生物杀死速率的提高要超过培养基成分的破坏速率的增加。

　　从上述的分析可知，在热灭菌过程中，同时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程的进行速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温度的升高更为显著。因此，可选择合适的灭菌温度和时间来调和二者之间的矛盾。

　　一个事例为，灭菌要达到杀死99.99%的细菌芽孢，有两种方法可以采用，一种是118灭菌15min，另一种是128灭菌5min。而培养基中B族维生素的保留值在前一种方式为90%，后一种方式为95%。由此可见，在高温下灭菌，时间是一个非常重要的因素，图5-6和表5-8分别表示杀死细菌芽孢与保留B族维生素的时间与温度关系以及在不降低规定的灭菌前提下()，灭菌温度、时间和营养成分破坏量的关系。

　　表5-8灭菌温度、时间与营养成分破坏量的关系()

　　灭菌温度灭菌时间(分)营养成分破坏量%

　　100 400 99.3

　　110 36 67.0

　　115 15 50.0

　　120 4 27.0

　　130 0.5 8.0

　　145 0.08 2.0

　　150 0.01 1.0

　　由此可见，若要减少营养成分的破坏，可升高温度灭菌。

　　据此，可以在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。

　　5.3.3影响灭菌的因素

　　1) 培养基成分

　　固体培养基的灭菌时间要比液体培养基的灭菌时间长。

　　2) 培养基的物理状态

　　培养基的PH值愈低，灭菌所需的时间就愈短。

　　3) 培养基的PH值

　　4) 培养基中的微生物数量

　　因此，在实际生产中，不宜采用严重霉腐的原料和腐败的水质，因为这类原料中不但有效成分少，而且微生物数量中，彻底灭菌比较困难。

　　5) 微生物细胞中水含量

　　6) 微生物细胞菌龄

　　年轻细胞容易被杀死。

　　7) 微生物的耐热性

　　各种微生物对热的抵抗力是不同的，细菌的营养体、酵母、霉菌的菌丝体对热较为敏感，而放线菌、酵母、霉菌孢子比营养细胞的抗热性要强，细菌芽孢的抗热性就更强。一般讲，无芽孢的细菌或霉菌孢子在100以下加热3-5min都可被杀死，但是有些细菌芽孢的热阻较大，100、30min仍未被杀死，所以灭菌的彻底与否应以杀死细菌孢为标准。

　　8) 空气排除情况

　　蒸汽灭菌过程中，温度的控制是通过控制罐内的蒸汽压力来实现。压力表显示的压力应与罐内蒸汽压力相对应，即压力表的压力所对应的温度应是罐内的实际温度。但是如果罐内空气排除不完全，压力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽压力，还包括了空气分压，因此，此时罐内的实际温度就低于压力表显示压力所对应的温度，凤致造成灭菌温度不够而灭菌不彻底，如表5-12所示。

　　表5-12蒸汽压力与温度的关系

　　蒸汽压力(atm) 相应的温度(℃)空气完全驱除程度罐内实际温度(℃)

　　0.3 107.7 完全驱除121.6

　　0.7 115.5 驱除非/3 115.0

　　1.0 121.6 驱除此之外/2 112.0

　　1.3 126.6 驱除此之外/3 109.0

　　1.5 130.5 全未驱除100.0

　　9) 搅拌

　　10) 泡沫

　　5.4间歇灭菌

　　5.4. 1间歇灭菌

　　培养基的间歇灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，通常也称为实罐灭菌。

　　间歇灭菌过程包括升温、保温和冷却等三个阶段，图5-7为培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况。

　　5.4.2间歇灭菌的计算

　　严格地讲在升温阶段的后期和冷却阶段的前期，培养基的温度很高，因而具有一定的灭菌作用。

　　由此可见，灭菌过程中加热和保温阶段的灭菌作用是主要的，而冷却阶段的灭菌作用是次要的，一般很小，可以忽略不计。此外，还应指出的是，应当避免过长时间的加热阶段，因为加热时间过长，不仅会破坏营养物质，而且也有可能引起培养液中某些有害物质的生成，从而影响培养过程的顺利进行。

　　在实际生产中，也可能遇到所供蒸汽不足、温度不够高的情况，这时可以适当延长灭菌

　　时间。生产上甚至有用100蒸煮而达到彻底灭菌的实例。如要做固体曲而没有高温蒸汽

　　时，可将原料用100蒸汽蒸30min，杀死其中的营养细胞，但孢子与细菌的芽孢没有被

　　杀死。将蒸过的原料置于室温下过夜，未被杀死的孢子便发芽生长，芽孢发育成营养细

　　胞，再蒸30min便可杀死。如此连续反复进行2-3次，亦可达到彻底灭菌的目的。

　　5.4.3间歇灭菌的操作

　　间歇灭歇是在所用的发酵罐或其他培养装置中进行的，它是在配制罐中配好培养基后，通过专用管道输入发酵罐等培养设备中，然后开始灭菌。在进行培养基的间歇灭菌之前，通常先将发酵罐等培养装置的分空气过滤器进行灭菌，并且用空气将分过滤器吹干。开始灭菌时，应先放去夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过空气管向发酵罐内的培养基通入蒸汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接加热。当培养基温度升到

　　70左右时，从取样管和放料管向罐内通入蒸汽进一步加热，当温度升至120，罐压为1*105Pa(表压)时，打开接种、补料、消泡剂、酸、碱等管道阀门进行排汽，当然在保温过程中，应注意凡在培养基液面下的各种进口管道都应通入蒸汽，而在液面以上的其余各管道则应排放蒸汽，这样才能不留死角，从而保证灭菌彻底。保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。

　　由于培养基的间歇灭菌不需要专门的灭菌设备，投资少，对设备要求简单，对蒸汽的要求也比较低，且灭菌效果可靠，因此，间歇灭菌是中小型生产工厂经常采用的一种培养基灭菌方法。

　　5.5连续灭菌

　　5.5. 1培养基的连续灭菌

　　培养基的连续灭菌，就是将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。图5-9为连续灭菌过程中温度的变化情况。由图可以看出，连续灭菌时，培养基可在短时间内加热到保温温度，并且能很快地被冷却，因此可在比间歇灭菌更高的温度下进行灭菌，而由于灭菌温度很高，保温时间就相应地可以很短，极有利于减少培养基中的营养物质的破坏。

　　5.5. 2连续灭菌的基本流程

　　培养基连续灭菌的基本流程如图5-10所示。连续灭菌的基本设备一般包括(1)配料预热罐，将配制好的料液预热到60-70，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声;(2)连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌温度(126-132);(3)维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的;(4)冷却管，从维持罐出来的料液要经过冷却排管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到40-50后，输送到预先已经灭菌过的罐内。

　　图5-11为喷射加热连续灭菌流程，流程中采用了蒸汽喷射器，它使培养液与高温蒸汽直接接触，从而在短时间内可将培养液急速升温至预定的灭菌温度然后在该温度下维持一段时间灭菌，灭菌后的培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器急速冷却，从图中可以看出，由于该流程中培养基受热时间短，营养物质的损失也就不很严重，同时该流程保证了培养基物料先进先出，避免了过热或灭菌不彻底等现象。

　　图5-12为薄板换热器连续灭菌流程，流程中采用了薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，蒸汽在薄板换热器的加热段使培养液的温度升高，经维持段保温一定时间后，培养基在薄板换热器的冷却段进行冷却，从而使培养基的预热、加热灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。该流程的加热和冷却时间比喷射加热连续灭菌流程要长些，但由于在培养基的预热过程同时也起到了灭菌后培养基的冷却，因而节约了蒸汽和冷却水的用量。

　　培养基的连续灭菌的优点是灭菌的温度较高，灭菌时间较短，培养基的营养成分受砉珠程度较低，从而保证了培养基的质量，同时由于连续灭菌过程不在发酵罐等设备中进行，提高了发酵罐等设备的利用率。当然与间歇灭菌过程相比，连续灭菌过程的不足之处是过程所需的设备较多，操作较为麻烦，染菌机会也相应较多。

　　培养基采用连续灭菌时，加热器、维持罐(管)和冷却器以及发酵罐等都应先进灭菌，然后才能进行培养基的连续灭菌。同时组成培养基的耐热性物质和不耐热性物质可在不同温度下分开灭菌，以减少物质的受热破坏程度，也可将碳源与氮源分开灭菌，以免醛基与氨基发生反应，防止有害物质的生成。

　　5.6间歇灭菌与连续灭菌的比较

　　间歇灭菌或连续灭菌都有各自的优点和缺点，现比较如下。

　　表5-14间歇灭菌与连续灭菌的比较

 

灭菌方式	优点	缺点
连续灭菌	1.        灭菌温度高，可减少培养基中营养物质的损失 2.        操作条件恒定，灭菌质量稳定 3.        易于实现管道化和自控操作 4.        避免了反复的加热和冷却，提高了热的利用率 5.        发酵设备利用率高	1.        对设备的要求高，需另外设置加热、冷却装置 2.        操作较麻烦 3.        染菌的机会较多 4.        不适合于含大量固体物料的灭菌 5.        对蒸汽的要求高
间歇灭菌	1.        设备要求低，不需另外设置加热、冷却装置 2.        操作要求低，适于手动操作 3.        适合于小批量生产规模 4.        适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌	1.        培养基的营养物质损失较多，灭菌后培养基的质量下降 2.        需进行反复的加热和冷却，能耗较高 3.        不适合于大规模生产过程的灭菌 4.        发酵罐的利用率较低

 

　　由表可见，无论在理论上或者在实践上，与间歇灭菌过程相比，连续灭菌的优点十分明显。因此，连续灭菌越来越多地被用培养基的灭菌。